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如何在多光子显微观察中改善深度成像质量

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使用多光子显微镜对活体小鼠视觉皮层进行深度成像

如今科学家想在神经生物领域全新的认知,需要比以前更加深入的探索。多光子显微成像因此而成为广受欢迎的成像技术。这一有力的成像工具,可以通过无创方式捕捉到活体组织中深层细胞的动态3D图像。

然而,研究人员往往会忽视多光子深度成像过程中存在的光学问题——球面像差。

我们将在本文中深入探讨多光子深度成像中的球面像差问题,以及相应的解决方法。

什么是球面像差?

简而言之,球面像差就是当光线穿过球面透镜后,在不同点汇聚从而产生的光学像差。光线无法在一个焦点处会聚,那么图像亮度和分辨率就会受到影响。比如说,球差会影响针对大脑深层部位树突棘等精细结构的观察,使研究变得困难。

幸运的是,显微镜物镜技术领域的创新可针对这一误差进行补偿及校正。科学家可使用物镜上的校正环移动内部透镜元件的位置并校正球面像差。但是,在深度成像过程中使用手动校正环矫正球面像差绝非易事。

通常存在以下两个问题:

  • 多光子系统的暗室环境下,研究人员难以看清校正环位置,调整会相当困难
  • 每次调整校正环时都会略微改变物镜的有效焦距

由于存在这些问题,通过手动方式在Z-stack图像三维采集过程中将校正环调整到多个位置就变得不切实际,继而无法保证研究者在每个深度都能捕捉到明亮和高分辨率率的图像。

为了解决这一问题,我们推荐使用诸如TruResolution物镜等电动透镜系统。这样解决存在两个好处:

1.简化用户操作

多光子显微术是一种先进的荧光成像技术,所以在没有显微镜专家在场的情况下,相关研究人员在捕捉图像方面可能会感到信心不足。电动物镜的自动球面像差校正可以大幅简化多光子在深层成像实验中的用户操作。其工作原理如下:

如下图所示,在转动传统校正环时,焦平面发生变化(图A,左)。相比之下,电动物镜可以根据转动角度自动更改物镜的Z轴位置,调整到合适焦面。其还可根据客观测量值(如图像对比度)优化校正环(图B,右)。

在多光子显微镜深层成像时校正球差

借助这项创新技术,通过软件控制简化操作,大大降低用户操作的复杂度。

可辨别活体小鼠视觉皮层小胶质细胞下方100μm深度处两幅图像的差别。与调整校正环之前捕捉的图像(左)相比,经过校正环自动校正后捕捉到的图像(右)更明亮,并且能够更好地分辨出细小的丝状突起。

使用多光子显微镜对活体小鼠视觉皮层进行深度成像

图片由麻省理工学院(MIT)的Mitchell Murdock提供。

2.在各种深度获得明亮、清晰的图像。

自动校正环可根据深度和折射率分布调整光学校正,帮助您捕捉到生物组织内部更明亮的图像和更精细的特征。

比如,神经科学家对穿过大脑深部区域亚微米特征(如树突棘的头和颈)的结构形态非常感兴趣。通过捕捉更清晰、更锐利的图像,他们能够更好地表征这些树突棘,以便对学习和记忆能力展开研究。

下面是研究实例。在最近的一项研究中,研究人员对颅骨开窗法制备的麻醉小鼠头部进行了感觉皮层的观察。

树突棘的活体深层成像

图片由RIKEN BSI-Olympus的Hiromu Monai、Hajime Hirase和Atsushi Miyawaki提供。

与使用传统固定校正环(右中C)所捕捉的图像相比,使用自动TruResolution物镜(右上B)捕捉的图像具有更高的分辨率和亮度。

相比固定校正环(右下E),使用TruResolution物镜可获得更高的图像质量,轻松观察到树突棘的细节(左下D)。

致力于更深入的探索

深层多光子成像可以帮助研究人员更好地了解诸如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和多发性硬化症等神经系统疾病及机制。我们为FVMPE-RS多光子激光扫描显微镜推出的物镜能够让您获得在细节上完美的清晰、明亮且精确图像,帮助您获得重大发现。

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产品经理

Carlo Alonzo博士是奥林巴斯科学解决方案部门的多光子显微镜和定制解决方案产品经理。他负责发现和了解那些能够支持科学家们实现其研究目标的技术。对于生物光学的兴趣让其进入波士顿学术圈,并在此花了数年时间沉浸于使用多光子显微镜的研究。他拥有菲律宾大学物理学博士学位,并在丹麦技术大学和哈佛医学院麻萨诸塞州总医院接受过博士后培训。

2019年12月12日
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